(1)線虫におけるメラトニンシグナルアッセイ系の構築と作用機構

と考えられており、また生物時計の調節や睡眠誘発作用があることから注目さ

メラトニンは夜間に分泌され、睡眠の誘導や概日リズムの制御に関与するホルモンです。分泌されたメラトニンは、膜受容体タンパク質であるGPCRの一種のメラトニン受容体に結合し、メラトニン受容体がG_iタンパク質三量体を介して細胞内に抑制性シグナルを伝達することで、最終的に睡眠の誘導などの生理作用をもたらします。これらの生理作用の重要性から、メラトニンおよびメラトニン受容体は、睡眠障害などの治療標的として注目を集めており、多くの作動薬が開発され、臨床に用いられていますが、これらの薬剤がどのようにしてメラトニン受容体に作用してシグナルを伝えるのかに関してはあまり分かっていませんでした。

ゴカイのメラトニン合成経路を明らかにするために、哺乳類におけるメラトニン合成 ..

近年、X線結晶構造解析によって、睡眠障害の治療薬が結合した状態でメラトニン受容体の立体構造が報告され、薬剤の認識機構などが解明されました。しかし一連の構造解析では、受容体の安定化のために様々な変異が導入された、生理活性を示さないような変異体が用いられていました。そのため、受容体を活性化状態にする作動薬が結合しているにも関わらず不活性化型の構造を示しており、生理的な状況を反映していない状態でした。以上から、メラトニン受容体がリガンドによって活性化するメカニズムは不明なままであり、治療薬の開発に求められる詳細な作動メカニズムは解明されていない状況にありました。

今回、東京大学大学院理学系研究科の岡本紘幸大学院生、西澤知宏准教授（研究当時）、濡木理教授らの研究グループは、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析法を用いて、リガンドが結合し活性化したメラトニン受容体MT₁およびG_iタンパク質三量体で構成されるシグナル伝達複合体の立体構造を解明しました（図1）。これにより、メラトニン受容体が活性化するメカニズムを明らかにしました。さらに、東北大学の井上飛鳥准教授の開発したG_iタンパク質三量体の活性化検出法を用いたメラトニン受容体の変異体解析により、先行研究では明らかとなっていなかった受容体の活性化に重要なアミノ酸残基を新しく特定することに成功しました（図2）。

トニン生合成経路を明らかにする必要があった。脊椎動物におけるメラトニン生合成経路は，トリプトファ.

一方で、GPCRの構造を網羅的に比較したところ、G_iシグナル伝達受容体では、細胞内側の空間がG_sシグナル伝達受容体に比べて狭いという特徴がわかりました（図4）。さらにG_sシグナル伝達受容体に比べて、G_iシグナル伝達受容体では細胞内ループなどを介した相互作用が弱く、G_iのC末端のみで相互作用していることが明らかになりました。イタリアScuola Normale Superiore di PisaのRaimondi准教授による構造情報を用いたバイオインフォマティクス解析の結果から、G_sシグナル伝達受容体間ではGタンパク質と受容体の相互作用が保存されている一方で、G_iシグナル伝達受容体ではばらつきが大きく、受容体ごとにやや柔軟な相互作用を形成していることが明らかになりました。以上からG_i共役とG_s共役の選択性はTM6の構造変化の程度の違いだけで決まるというこれまでの考えに対し、受容体の細胞内側の空間的な特徴や、細胞内ループを介したGタンパク質との相互作用など、より多くの要素が複合的に選択性に寄与することが明らかになりました。

本研究における活性化型のメラトニン受容体の立体構造と、先行研究のX線結晶構造解析による不活性型の立体構造とを組み合わせることで、計算機シミュレーションによるメラトニン受容体の薬剤探索が加速することで、不眠症や、時差ボケなど概日リズムの乱れによる体調不良に対する治療薬の開発へとつながることが期待されます。

実験用マウスはメラトニンを合成できないので合成できるようにした

メラトニンは、哺乳類において松果体から周期的に分泌され、生体リズム調節作用を示すことが知られているアミンである。これまでにその合成経路から受容体、周期的な遺伝子発現制御に至るまでその生理機構について多くの研究がなされている。しかし、メラトニンは明確な概日リズムが存在しない様々な無脊椎動物から植物や菌類に至るまで生物界全般に広く分布しており、ただ単にリズム調節を司るのみとは考えにくい。また近年、ラット海馬におけるLTPの抑制といったリズム調節以外の機能の例も報告されている。これらの報告から、メラトニンは神経活動の直接的制御等、様々な生体機能に根源的かつ重要な役割を果たしている可能性が高いと考えた。海外ではメラトニンは睡眠障害時に使用され、その副作用についても疑問視されているが、リズム調節以外の機能に関する研究はこれまでに殆ど行われていない。

私は、メラトニンの持つ新たな生理的・薬理学的な作用基序の解明と、その生物学的・進化的な役割の解明を通して、生体内におけるメラトニンシグナル伝達の詳細な理解を目的として本研究を行つた。そのために、セロトニンやドパミンといったアミン類の作用機構の解析例も豊富で、また遺伝因子の同定が容易なモデル生物線虫(C.θZθ9卿5)を使用した。線虫を使用したメラトニン研究は殆ど例がなかつたため、本研究ではまず線虫を使用したメラトニンシグナルのアッセイ系を構築し、そのアッセイ系を使用してメラトニンの作用機構の解析、メラトニンシグナル経路で機能する因子の探索等を試みた。以下その内容について記載する。

カイコガ幼虫と成虫の頭部におけるメラトニン合成経路関連物質の昼夜変化

メラトニン(N-acetyl-5-methoxytryptamine)はウシ松果体より単離されたインドール化合物である。脊椎動物の松果体や網膜におけるメラトニンの合成は,暗期に亢進,明期に抑制され,その結果,血中メラトニン濃度も同様の動態を示すことが報告されてきた。メラトニンはこの日周リズムゆえに環境の光周期に関する情報を伝達するホルモンであると考えられており,哺乳類においては,繁殖期の決定やサーカディアンリズムの同調に重要な役割を果たしていることが知られている。しかしながら,魚類におけるメラトニン動態やメラトニンによる情報伝達機構に関する知見は乏しく,基礎的な知見をさらに積み上げていかなければならない状況にある。そこで,本研究においては,魚類におけるメラトニン合成の調節機構からメラトニン受容体による情報伝達系までを一連のプロセスとしてとらえ,総合的に研究を行った。本研究の概要は以下の通りである。

インシュリンに対する応答の場合､細胞内のcAMP濃度が下がり、グリコーゲンの代謝は分解（異化）から合成（同化）に切り替わり（）、細胞に取り込まれたグルコースはグリコーゲンに変えられる。

インシュリンの作用機構は極めて複雑であるが、ホスホプロテインホスファターゼ-1 (phosphoprotein phosphatase-1)が標的酵素の１つである。インシュリンはインシュリン依存性プロテインキナーゼ(protein kinase、タンパク質のリン酸化を触媒する)を活性化し、これがさらにホスホプロテインホスファターゼ-1をリン酸化して活性化する。これがさらにグリコーゲン合成に関わる酵素を脱リン酸化してグリコーゲン分解を抑え（グリコーゲン分解系の酵素は脱リン酸化型は不活性）、グリコーゲン合成を促進する（グリコーゲン合成酵素glycogen syntaseは逆に脱リン酸化型が活性型）。
筋肉においては、インシュリンとアドレナリン(adrenalin)は逆の効果を及ぼす。アドレナリンはcAMP依存性タンパク質キナーゼ(cAMP-dependent protein kinase, 略称A-kinase)を活性化し、グリコーゲン分解を促進し、グリコーゲン合成を抑える。

合成・分泌されるメラトニンがこの作用において重要な役割を演じている。 3.光によるメラトニン分泌の制御

第一の表現型として、メラトニン処理により線虫体壁筋の収縮頻度(bodybend回数)が一過的に減少することを明らかにし、この作用に基づいたアッセイ系を確立した。作用発現時間の経過から、メラトニンは遺伝子発現を介さずに直接神経の活動を抑制すると推測された。また、体壁筋の収縮頻度以外の様々な筋収縮や行動には影響が見られなかったことから、メラトニンは全ての神経の活動に非特異的に関与するのではなく、一部の神経群に存在する特異的なシグナル経路を介して作用することが強く示唆された。

メラトニン合成はヒト及びその他の哺乳類で露光することにより支配され、主として ..

魚類における血中メラトニン濃度が日周リズムを示すか否かを明らかにするために,ウグイ,オイカワ,ナマズ,サクラマス,ヒラメ,マダイ,カンパチ,ブリを用いて,明暗条件下における血中メラトニン濃度を測定した。その結果,どの種においても血中メラトニン濃度は暗期に高く,明期に低い日周リズムを示すことが判明した。また,サクラマスとマダイの血中メラトニン濃度におよぼす日長の影響について検討したところ,血中メラトニン濃度の高値持続時間は暗期の長さによって規定されることが明らかになった。これらの結果から,魚類の血中メラトニン濃度は魚種にかかわらず,暗期に高く,明期に低い日周リズムを示すことが明らかになった。

メラトニンとは、脳の奥深くにある「松果体」という器官から分泌されるホルモンの一種。 ..

キンギョの血中,松果体および眼球内メラトニンの動態について比較検討した。まず,眼球にメラトニンが存在することを高速液体クロマトグラフィーとラジオイムノアッセイの組み合わせにより確認した。次に,明暗条件下における血中メラトニン濃度,松果体および眼球内メラトニン含量を測定したところ,三者とも暗期に高く,明期に低い日周リズムを示すことがわかった。続いて,眼球除去,松果体除去実験を行った結果,血中メラトニン濃度の日周リズムは松果体が作り出していることが確認された。さらに,血中メラトニン濃度と眼球内メラトニン含量の日周リズムにおよぼす日長の影響を検討したところ,キンギョにおいてもメラトニンの高値持続時間は短日条件下の方が長日条件下よりも長いことがわかった。最後に,暗期の開始時から明期を延長して持続性の,また,暗期開始5時間後より急性の光照射(300,1,500lx)を行いその影響について検討した。その結果,持続性光照射により血中メラトニン濃度の日周リズムは失われたが,眼球内メラトニン含量の日周リズムは300lx照射群では振幅が小さくなったものの存続した。一方,急性光照射時には,血中メラトニン濃度は照射開始後直ちに減少し.低い値を維持した。眼球内メラトニン含量は,300lx照射群においては変化を示さなかったが,1,500lx照射群においては照射開始1時間後になってはじめて減少した。急性光照射時の血中メラトニン濃度の経時変化より計算された血中メラトニンの半減期は,300lx照射群においては11.0分,1,500lx照射群においては16.8分であった。以上の結果から,キンギョの松果体と眼球におけるメラトニン合成は互いに独立していること,血中メラトニン濃度の日周リズムは松果体が作り出していること,松果体のメラトニンリズムの方が眼球よりも光感受性が高いことが明らかになった。

[PDF] 項 内 容 名称 メラトニン、松果体ホルモン [英]Melatonin [学名]

既知のメラトニン受容体にはMT1、MT2、MT3の3種類のサブタイプが存在する。それぞれの受容体のアンタゴニストを用い、どの受容体経路を介して線虫の体壁筋収縮が制御されているのかを解析した。その結果、MT2、MT3特異的アンタゴニストはメラトニンの作用を抑制せず、MT1/2受容体アンタゴニストのみがメラトニンの作用を抑制した。従つて、線虫にはMT1様受容体が存在し、メラトニンはこの受容体を介して体壁筋の収縮頻度を調節することが示唆された。

メラトニン（めらとにん） 松果体（しょうかたい）から分泌されるホルモン。 2024年2月1日

第二の表現型として、MT3受容体アンタゴニストに線虫を長期間暴露することで、体長の増加抑制、腸内穎粒の減少等の影響が顕れることを見出した。他のアンタゴニストの作用ではこの現象は観察されない。従って、線虫にはMT3様受容体も存在し、内在性のメラトニンがMB様受容体を介して様々な生命現象に恒常的に関わっていることが示唆された。

[PDF] メラトニン 2.6.4 薬物動態試験の概要文 -1

メラトニン処理等により様々な表現型異常が観察されたことから、線虫体内のメラトニンの有無について検討を行つた。HPLC及びLC/MS/MSを用いて線虫抽出物を分析したところ、両者においてメラトニンに対応するピークが得られたことから、線虫体内にはメラトニンが存在することが分かった。メラトニンが合成される細胞群を明らかにするため、その合成酵素の発現パターンの解析を試みた。ゲノム情報からY74CgA.3遺伝子が線虫におけるメラトニン合成酵素HIOMTに相当すると考えられ迄ため、この遺伝子の発現解析を行った。その結果、この遺伝子はPVT神経と子宮に発現していた。従って、少なくともこれらの細胞においてはメラトニンが生合成され、観察された行動や恒常性に関与する細胞群に作用すると推測された。

•メラトニンは生体内で合成される内分泌ホルモンであることから安全性が高い

環境要因がキンギョの血中メラトニン濃度の日周リズムにおよぼす影響について検討するために.季節,水温,および光周期の影響について調べた。まず,自然条件下で季節変化を調べたところ,明期の値は年間を通じて低かったが,暗期の値は季節変化を示し,6月,9月に高く,12月,3月に低い値を示すことが判明した。これらの変化は水温の変化と有意な相関を示したことから,実験的に水温が血中メラトニン濃度の日周リズムにおよぼす影響について,5,15,25℃と水温を変化させて調べた。その結果,光周期にかかわらず,暗期の血中メラトニン濃度は25℃>15℃>5℃の順になった。また,水温にかかわらず,血中メラトニン濃度の高値持続時間は暗期の長さによって規定されていることが判明した。これらの結果から,キンギョの血中メラトニン濃度の日周リズムは環境の光条件と水温の双方に影響を受けた季節変化を示すことが明らかになった。

の波長依存性，紫外線のメラトニン合成に対する影響にっいて，斉藤和雄教授より，メラトニン.

キンギョにおけるメラトニンリズムが生物時計による調節を受けているか否かを明らかにするため,恒常条件下でサーカディアンリズム(周期が約24時間の自由継続リズム)を示すかどうか調べた。キンギョにおける血中メラトニン濃度は,恒暗条件下では3日間サーカディアンリズムを示し,明暗条件下の暗期に相当する時刻に高い値を,明期に相当する時刻に低い値を示した。一方,眼球内メラトニン含量は2日間はサーカディアンリズムを示したが,3日目にはリズムは失われた。恒明条件下においては,血中メラトニン濃度は低い値を保ち,変化を示さなかったが,眼球内メラトニン含量は,恒暗条件下に比べて振幅は小さかったものの,サーカディアンリズムを示した。次に松果体の灌流培養を行ったところ,明暗条件下,および逆転した明暗条件下では,メラトニン分泌は暗期に高く,明期に低い日周リズムを示した。恒暗条件下では,周期が23.6ないし24.9時間のサーカディアンリズムを示したが,恒明条件下ではメラトニン分泌は抑制され,リズムは失われた。最後に培養時刻と光条件がキンギョ眼杯標本からのメラトニン分泌量と眼杯におけるメラトニン含量におよぼす影響を検討したところ,明期(1130hr)に眼杯標本を作成し,1200-1500hrの間培養した場合には,メラトニン放出量,メラトニン含量ともに明条件群と暗条件群の間に差は認められなかった。暗期に入る直前(1730hr)に眼杯標本を作成し,1800-2100hrの間培養した場合には,メラトニン放出量,メラトニン含量ともに,暗条件群のほうが明条件群よりも高い値を示した。また,これらの実験の明条件群,暗条件群それぞれにおいて,1800-2100hr培養群の方が,1200-1500hr培養群よりも高い値を示し,培養時刻が眼杯におけるメラトニン産生に影響をおよぼすことが判明した。これらの結果から,キンギョにおけるメラトニンリズムは環境要因のみならず内因性の生物時計による制御も受けていることが明らかになった。

質の良い睡眠をとるためには、メラトニンの分泌を高めることが大切です。

今回、東京大学大学院理学系研究科の濡木理教授らのグループは、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析法でメラトニン受容体MT₁とG_iタンパク質三量体で構成されるシグナル伝達複合体の立体構造を解明しました。さらに国内外の複数の研究室との共同研究の下で機能解析やバイオインフォマティクス解析を行い、受容体の活性化メカニズムやG_iタンパク質三量体と選択的に結合する機構を明らかにしました。この研究成果により、睡眠障害の治療薬開発が促進されると共に、GPCRとGタンパク質との選択的なシグナル伝達に関する研究が進展することが期待されます。

起こらない． マサバとトラフグでも卵黄形成期の卵濾胞組織では，P5.

哺乳類のMT1受容体は、G蛋白質共役受容体に属している。そのため、線虫の筋収縮を制御するメラトニンシグナルもG蛋白質と共役した受容体を介していると推測した。そこで様々なG蛋白質突然変異体を用いてMT1経路を介したメラトニンの感受性を検討した。その結果、Gqα をコ一ドする8gZ -30の機能元進及びgアα-7の機能欠損変異体がメラトニンに対する感受性異常を示したため、線虫のMT1様受容体はEGL-30及びGPA-7を介したシグナル伝達により制御されていると推測された。